PCR-Test

Was kann der Test leisten? Und was wissen wir darüber, wie er eingesetzt werden sollte? Und wie wird er tatsächlich eingesetzt?

 

 letztes Update 2024-07

Das PCR-Prinzip – einfache Darstellung

In diesem Abschnitt geht es darum, einen Eindruck davon zu vermitteln, wie der PCR-Test funktioniert und welche Bedeutung der ct-Wert hat.

Vereinfachte Darstellung: von Vervielfältigung und ct-Wert

Die einfache Beschreibung geht so: Der Testprobe werden Primer zugesetzt. Diese lagern sich an ganz bestimmte Genabschnitte des gesuchten Gens an, falls dieses vorhanden ist. Im Falle der PCR-Tests auf Sars-Cov-II sind das dann Genabschnitte, die Sars-Cov-II zugeschrieben werden. Ausgehend von den Primern werden dann Gensequenzen kopiert und die gesuchten Genabschnitte damit verdoppelt. Das Kopieren geschieht wiederholt. Eine Wiederholung wird als Zyklus bezeichnet. Mit jedem Zyklus werden die vorhanden geprimten Gensequenzen verdoppelt. Der Zyklus, bei dem die gesuchte Gensequenz dann nachweisbar sichtbar wird, ergibt den ct-Wert. Je mehr Verdopplungen benötigt werden, desto höher ist der ct-Wert (ct steht für cycle threshold).

Wenn in der Probe 1 DNA Stück vorhanden ist, an das die Primer andocken, dann gibt es nach:
– 20 Zyklen: 00.000.001.048.576 = ca. 1 Million Stücke
– 30 Zyklen: 00.001.073.741.824 = ca. 1 Milliarde Stücke
– 45 Zyklen: 35.184.372.088.832 = ca. 35 Billionen Stücke

Was ist nun daraus für die Bewertung von Testergebnissen relevant?:
– Es geht nicht um den Nachweis des vollständigen Virus, sondern um den Nachweis von kleinen Sequenzen aus dem Genom des Virus. Die können von einem vollständigen Virus stammen aber auch von Bruchstücken.
– Der ct-Wert liefert einen Anhaltspunkt dafür, wieviel der gesuchten Teilabschnitte von Sars-Cov-II in der Probe waren.

 

PCR – mit mehr Details

Dieser Abschnitt ist für Detail-Freaks gedacht. Menschen, die mehr über die konkreten Mechanismen wissen wollen. Der Abschnitt ist eine Vorbereitung dafür, die Diskussion um das Corman-Drosten-Papier und das dort vorgeschlagene PCR-Testprotokoll besser nachvollziehen zu können.

Die Mechanismen im Detail

Die einfache Beschreibung wird mit leichten Variationen häufig präsentiert. Aber wie sehen die Schritte im Labor im einzelnen aus? Erfahrungsgemäß kommen weitere Fragen und Hinweise auf weitere Qualitätskritierien und Stolpersteine zum Vorschein, wenn dem Mechanismus auf den Grund gegangen wird. Detaillreiche für Laien verständliche Darstellungen zu finden, aus der sich eine nachvollziehbare Reihe von Prozessschritten ergibt, ist gar nicht so einfach. Folgende habe ich gefunden und dazu noch ein paar Einzelhinweise:

• Illa (2021): Das PCR-Desaster. Zur Genese und Evolution des »Drosten-Tests«. pdf-Download oder Softcover.
• Der Betrug mit dem PCR-Test auf peds-ansichten.de (Januar 2021)
• Corona-Test: Wie der PCR-Test funktioniert und wie zuverlässig er ist auf galileo.tv.
• Polymerase-Kettenreaktion Stichwort auf Wikipedia

Die folgende Darstellung ist die Darstellung eines unfertigen Puzzles. Aber wie ich finde es lohnt sich, und sooo kompliziert ist es nun auch nicht, als dass es nicht vermittelbar wäre … Los geht’s:

RNA-Extraktion / Reinigung der Probe

Beispiel für eine RNA-Extraktionsmethode: Die Probe wird in ein Reagenzglas gegeben und bei Raumtemperatur mit „TRIzol“ 5 Minuten inkubiert. Dann kommt Chloroform hinzu. 3 Minuten ziehen lassen, ab und zu umdrehen und dann 15 Minuten zentrifugieren mit 12.000 ×g bei 4°C. Dann die obere wässrige Schicht mit der RNA abschöpfen und in ein neues Reagenzglas geben. Isopropanol dazu. 10 Minuten auf Eis ziehen lassen. Vorsichtig umrühren und nochmal zentrifugieren. Nun die klare Flüssigkeit verwerfen und den übriggebliebenen Pellet mit 70%igem Ethanol waschen. Nochmal zentrifugieren und klare Flüssigkeit verwerfen. Den Rest trocknen und dann in rna-freiem Wasser auflösen. (Quelle: nature.com, Abschnitt RNA-Exctraction.)

Also erstaunlich, so als Laie, finde ich. Was passiert da? Dient das dem Aufbrechen der Virushülle? Also leben tut in der Probe wahrscheinlich nichts mehr – was es an der Stelle auch nicht braucht. (Angeblich werden Verfahren dieser Art auch zur „Isolation“ von Viren verwendet, was aber ein anderes Thema ist.) Was mich interessieren würde, ob vollständige Viren oder Chromosomen durch dieses Verfahren in Bruchstücke zerlegt werden und wenn ja in wieviele Bruchstücke. Zum Beispiel, um abschätzen zu können, ob auch die gesuchten Gensequenzen vielleicht gebrochen und damit schlechter nachweisbar werden.

Reverse Transkription

Nun ist der Sars-Cov-II Virus ein RNA-Virus. Das PCR-Verfahren funktioniert aber mit DNA. Deshalb muss nun mögliche RNA in der Probe zunächst zu DNA ergänzt werden. Dazu werden ein Enzym Transcriptease und die benötigten DNA-Bausteine (Nukleotide) zur Probe gegeben. Ein PCR-Verfahren, dem dieser Schritt vorgeschaltet ist, wird als RT-PCR bezeichnet.

Hinweise, dass bei diesem Prozessschritt etwas schief gehen könnte, habe ich nicht gefunden.

Auftrennung / Denaturierung

Als nächstes wird die Probe für ein paar Minuten auf 95° erhitzt. Bei dieser Temperatur trennt sich die komplementär doppelsträngige DNA in ihre beiden Stränge auf.
(Mehr zur Denaturierung in dem Buch PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, S. 8.)

Idee der PCR (Polymerase Chain Reaction)

Es wird für beide Teilstränge eine Stelle bestimmt, ab der die Teil-DNA wieder zu einer doppelsträngigen DNA ergänzt werden soll. Um diese Stelle zu bestimmen werden Primer konstruiert. Diese können sich an eine ganz bestimmte Gensequenz anlagern. Es gibt einen Primer für den einen Strang und einen anderen für den komplementären Strang. Dann werden Bausteine (Nukleotide) und die Kopiervorrichtung () zugegeben und die DNA-Teil-Stränge beginnend mit dem Primer wieder ergänzt.

Diese Schritte werden wiederholt. Es wird wieder auf 95 C° erhitzt, die Stränge wieder aufgespalten u.s.w. Im Wesentlichen wird so in jedem Schritt die Gensequenz verdoppelt, die mit den beiden Primern abgesteckt wird.

Fragen zum Genom von Sars-Cov-II

Mit den Primern soll eine für das Virus charakteristische Gensequenz aufgespürt und vervielfältigt werden. Zu diesem Zweck muss die Gensequenz des Virus bereits bekannt sein. Was bei der Identifikation und Sequenzierung von Viren im allgemeinen und Sars-Cov-II im speziellen gemacht wird, ist für mich als Laie undurchschaubar. Es kann sein, dass es sich um weitgehend zusammengewürfelten Blödsinn handelt; es kann aber auch sein, dass die Methode von Quereinsteigern nicht durchschaut wird, bzw. dass sie nicht vollständig dargestellt wird. Konkret geht es um Probleme bei der Isolierung und Identifikation der Partikel als ein bestimmter Virus und bei der Sequenzierung.

Ein Beispiel für eine „Isolierung“ findet sich hier: Understanding virus isolates, variants, and strains. Dort findet die „Isolierung“ statt, indem die Lunge einer Patientin punktuell mit einer Flüssigkeit gespült wird. Die wieder entnommene Flüssigkeit wird dann als Isolat bezeichnet und für Zellkulturversuche verwendet.
Eine andere Beschreibung von „Isolierung“ gibt Tolzin (2020): Über Viren und Einhörner, impfreport 128/129, S. 74: „Was hat man in den Laboren stattdessen gemacht? Wir haben uns auch alle Studien angesehen, in denen behauptet wird, man hätte das Virus isoliert und sogar getestet. Doch tatsächlich wurde dies in keiner Studie vollzogen. Stattdessen wurde etwas ganz anderes getan. So die haben die Forscher Proben aus dem Rachen oder der Lunge von Patienten genommen, haben diese ultrazentrifugiert (in Hochgeschwindigkeit geschleudert), um die größeren/schwereren von den kleineren/leichteren Molekülen zu trennen. Anschließend haben sie den Überstand, also den oberen Teil des zentrifugierten Materials (auf Englisch „supernatant“), genommen. Und dies nennen sie dann „Isolat“, auf das sie die PCR anwenden.„

In der ersten Sequenzierung von Sars-Cov-II, ist das Virus gar nicht in einem Guß durchsequenziert worden, sondern irgendwie plausible Gensequenzen sind zu einem Genom von Sars-Cov-II zusammengesetzt worden. Siehe zu diesem Thema bspw. den Beitrag auf peds-ansichten.de. Oder Only Poisoned Monkey Kidney Cells ‚Grew‘ the ‚Virus‘ auf drtomcowan.com. Dort auch ein Link zum Originalsequenzierungsbeitrag der CDC. Mindestens so irritierend ist, dass sich mit der Lösung, die Sars-Cov-II enthalten sollte, keine menschlichen Zellkulturen befallen ließen, sondern nur eine traktierte Linie von Affennierenzellen!

Da tun sich sehr grundlegende Verständnisfragen auf. Für Aufklärungshinweise bin ich dankbar.

Anlagerung der Primer

Zurück zum PCR-Verfahren. Dann werden die Primer und die Baustoffe (Nukleotide) zugegeben. Die Anlagerung der Primer an die gesuchte Teil-DNA-Sequenz geschieht bei einer Temperatur im Bereich 45-68°C.

Länge der Primer
Die Primer bestehen aus 18-30 Nukleotiden. (Zu Nukleotiden und DNA siehe den Galileo-Beitrag.) Zum Vergleich: Das Sars-Cov-II Virus soll ein relativ großes Virus sein mit einer Länge von ca. 30.000 Nukleotiden.
Als maximale Länge der Gensequenz, die mit PCR-Verfahren vervielfältigt werden kann, meine ich gelesen zu haben etwa 3.000 Basenpaare wären möglich, bei dem üblichen Verfahren (Quelle?).

Kurzer Überschlag: Die DNA hat 4 Buchstaben. Bei einer Länge von sagen wir 16 Nukleotiden ergeben sich 4 hoch 16 gleich 4.294.967.296 Möglichkeiten. Bei einer Länge von 17 entsprechend das vierfache also etwa 17 Millionen Möglichkeiten. Das sieht für mich danach aus, dass jedes zusätzliche Nukleotid die Spezifität erhöht, richtig?

 

Auswahl der Primer
Da mit einem PCR-Test nur eine relativ kurze Gensequenz nachwiesen werden kann, wird empfohlen (Quelle?) zur Absicherung eines positiven Tests, den Test um die Suche auch 2 weitere Genstellen zu ergänzen. Am besten eine Gensequenz aus dem Anfangsbereich des Virus, eine aus der Mitte und eine aus dem Ende. Wenn alle 3 Tests positive Ergebnisse bringen, dann ist es auch wahrscheinlich, dass das Virus in der Probe vollständig vorgelegen hat. Außerdem werden so Falschpositive aufgrund von Anlagerung der Primer an nur ähnliche Gensequenzen anderen Ursprungs kontrolliert. Und es wird der Fall kontrolliert, dass die gleiche Gensequenz von einem anderen Lebewesen verwendet wird und in diese Probe gelangt ist.

Konzentration der Primer
Zwischen 0,1 und 0,5 mikro M. Höhere Konzentrationen führen zu unspezifischen Anbindungen (Primer-Dimer). (Quelle: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, S. 9.)

Wie spezifisch ist die Anlagerung?
Der aktuell einzige Hinweis, den ich dazu habe, ist ein Kommentar zu einem Beitrag auf thetruthseeker.co.uk. Der Kommentator gibt an, selbst mit PCR-Tests gearbeitet zu haben. Er sagt, dass auch Gensequenzen verdoppelt würden, bei denen die Übereinstimmung von Primer und Teil-DNA-Strang nur 50% betragen.

Welche Rolle spielt die Temperatur?
Die Temperatur kann wohl auch so gewählt werden, dass die Primer eher unspezifisch binden und so mehr falsch positive Testergebnisse erzeugt werden. Dies geschieht umso eher, je tiefer die gewählte Temperatur ist. Ist die Temperatur zu hoch, dann bindet der Primer nicht mehr. Typischer Temperaturbereich 55-65°C. Quelle Wikipedia)

Rolle anderer Ingredienzien
Nach unbestätigtem Kommentar wieder zu dem Beitrag auf thetruthseeker.co.uk7 gibt es weitere Parameter, mit denen sich die Anzahl der DNA-Kopien beeinflussen lässt: „The concentration of the amplified DNA product depends on the particular type and concentration of the genetically modified DNA polymerase enzyme as well as concentrations of magnesium, concentration of DNTPs, concentration of original DNA sample, buffer concentration and constituents, denaturation temperature, annealing temperature as well as extension temperatures. All these could be manipulated to get a desired outcome.“ Irgendwelche Experten, die dazu was sagen können?

Amplifikation

Wenn die Primer angedockt haben, wird die Temperatur auf ca. 70 °C erhöht. Die DNA-Polymerase baut dann bei den Primern beginnend Nukleotide an und ergänzt die Teil-DNAs wieder zu doppelsträngiger DNAs.

Mir sind keine Hinweise begegnet, dass etwa die Wahl der Temperatur Auswirkungen auf die Exaktheit des Ergängungsvorgangs hätte.

Mit diesem Schritt ist ein Zyklus vollendet, und die Vermehrung der DNA-Abschnitte geht wieder mit der Auftrennungsphase weiter.

Anzahl der Zyklen und Ergebnis ablesen

Wenn ich das richtig verstanden habe, ist es so: Bei den Standard-PCR Verfahren, wird im Vorhinein die Anzahl der Zyklen festgelegt. Wenn die Zyklen durchlaufen worden sind, dann wird das erhaltene Material mit einer Elektrophorese ausgewertet (vgl. Standard-PCR-Protokoll auf sigmaaldrich.com, Beispielbilder vgl. … detection protocols … auf nature.com).

Beim Real-Time PCR werden fluoreszierende Moleküle in die ergänzten DNA-Stränge eingebaut. Je mehr DNA vervielfältigt worden ist, desto mehr von dieser Fluoreszenz kann gemessen werden. Es wird eine Fluoreszenzmenge bestimmt, ab der einen Probe als positiv gilt. Der Zyklus bei dem diese Menge erreicht wird, ist dann der ct-Wert (ct für cylce threshold).

Sättigungsphase, Plateau-Effekt

Die Verdopplung geht übrigens nicht unendlich weiter, sondern irgendwann stellt sich eine Sättigung ein und es wird kaum noch DNA kopiert. Wenn es soweit gekommen ist, entstehen wohl auch mehr Nebenprodukte, was vielleicht interessant ist, wenn mit dem PCR-Verfahren DNA zur Weiterverwendung hergestellt werden soll. Einzelheiten auf dem Beitrag zum Real Time PCR auf Wikipedia. Oder auf dem PCR-Beitrag der National Library of Medicine.

Fazit, PCR-Details

Es gibt eine Reihe von Einflussmöglichkeiten, um mehr oder weniger falsch-positive Testergebnisse zu bekommen. Dazu zählt der ct-Wert, die Wahl von Anzahl und Art Primer, die Konzentration der Primer, die Temperatur bei Anlagerung der Primer. Weitere Zutaten haben auch einen Einfluss, der aber in den von mir gesichteten Quellen nicht näher ausgeführt wird.

 

Tests eichen und kalibieren

In diesem Abschnitt geht es darum, das Thema „Tests kalibrieren“ anzuwärmen. Wenn die Tests als einziges Bestimmungskritierum für eine Infektion verwendet werden sollen, also ohne klinische Symptome bei der Diagnose mit zu berücksichtigen, dann ist es wichtig, dass der Test keine falsch positiven Ergebnisse erzeugt.

Im Sinne der Aussagekraft und Vergleichbarkeit sollten die Tests Qualitätskontrollen durchlaufen:

• Wie gut werden Sars-Cov-II Viren in der Probe erkannt? (falsch-negativen, Sensitivität)
• Werden fälschlicherweise auch andere Erreger erkannt? Wenn ja welche?
  Wie wahrscheinlich sind falsch-positive insgesamt? (Spezifität)
• Wie entwickeln sich die ct-Werte bei einer bekannten Konzentration von Sars-Cov-II in der Probe (Vergleichbarkeit zwischen den Testkits)
• Labore evaluieren

Um diese Tests durchführen zu können, braucht es Referenzproben mit bekannter Sars-Cov-II Konzentration. Ob es solche Proben gibt, ist für mich nicht klar ersichtlich. Es laufen widersprüchliche Informationen dazu herum. Zum einen gibt es niemanden, der behauptet, Sars-Cov-II isoliert zu haben. Dann wurde das Genom von Sars-Cov-II wohl nicht von einem ganzen Virus ausgehend durchsequenziert, sondern Bruchstücke als zu diesem Virus zugehörig befunden und so das Genom reproduziert (vgl. peds-ansichten.de, Abschnitt „Vom SARS-CoV-2 — Virus“). Also ein bisschen so, wie das Aussehen von Dinosauriern aus Knochenfunden rekonstruiert wird. Andererseits gibt es ja deutliche Hinweise darauf, dass an dem Virus labortechnisch gearbeitet worden ist, was voraussetzt, dass dieser Virus in bearbeitbarer Form vorhanden ist. Und es gibt in einem Artikel zur PCR-Testentwicklung den Hinweis, dass sie Referenzproben zur Kalibrierung genommen haben (Optimization of primer sets […], Abschnitt „SARS-CoV-2 RNA as a positive control“).

Update 2024-07
Ich habe bei MWGFD nachgefragt, und tatsächlich, einen Hinweis auf einen informativen Text erhalten, der nochmal eine ganze Reihe von Fragen klärt:

Kämmerer et al zu PCR-Tests

RT-PCR Test Targeting the Conserved 5′-UTR of SARS-CoV-2 Overcomes Shortcomings of the First WHO-Recommended RT-PCR Test | International Journal of Vaccine Theory, Practice, and Research, ijvtpr.com

Wenn du dir den Text ansiehst, lasse dich nicht durch das Kapitel zur Entwicklung eines eigenen PCR-Testverfahrens aufhalten. Im Anschluss an dieses Kapitel gibt es weitere Informationen zum Verlauf der Coronakrise und der Rolle der PCR-Tests.

Eine Besprechung der Studie auf report24.com: Sensations-Studie beweist unfassbare Fehlerquote bei PCR-Tests und fordert Konsequenzen

Ergänzende Hinweise zu PCR

The only approach that would drive false-positives to zero requires performance of Sanger sequencing (Lee, 2021).

Der vorstehende Absatz beantwortet die Frage, wie PCR-Tests geeicht werden können: In dem die Proben auch einer Sanger-Sequenzierung unterzogen werden.

Using nested RT-PCR followed by Sanger sequencing to retest 50 samples sold as RT-qPCR positive reference confirmed 21 (42%) false-positives (Lee, 2022).
Seite 4

Das weist auf Problem bei der Qualitätssicherung hin: Wenn schon die Proben, die zur Qualitätskontrolle verwendet werden, falsch-positiv sind, dann werden damit eingestellte PCR-Testverfahren wohl auch falsch positive liefern.

Und weitere Hinweise darauf, wie schnell falsch positive generiert werden:

Basile et al. (2020)
reported a false-positive rate of RT-PCR testing of 11% (13/122), at a time when COVID-19 prevalence was 2%. Only two of the 13 false-positives had SARS-CoV-2 serology available, both were negative for
SARS-CoV-2, while one was positive for a rhinovirus. The problem of contamination has been addressed very early by Wernicke et al. (2020), who reported Ct-values as low as 17 for negative controls indicating high levels of contamination in reagents obtained from oligonucleotide suppliers. Therefore, each batch of PCR reagents must be pre-tested before using it in routine diagnostics.

Finally, it was noticed that detection of the target genes showed enormous variation between laboratories with respect to Ct-values. For example, the Ct-values for the same diluted sample of SARS-CoV-2 (sample number 340061) ranged between 15-40 for the E-gene, 20-40.7 for the N-gene and 19.5-42.8 for the RdRp-gene. Obviously, the largely different Ct-values for the different gene targets based on the same target demonstrate the different sensitivity of the targets and are largely influenced by the initial
amplification success. Since PCR is a 2-logarithmic process, any small initial problem will increase logarithmically as well. This highlights the need for a control standard curve to be included in every PCR to rate the results.
Seite 17

Wie das Corman-Drosten Protokoll falsch-positive Testergebnisse provoziert

Die Studie enthält eine ganze Reihe von Hinweisen auf Qualitätsmängel und Verstöße gegen die gute Praxis, die zu mehr falsch positiven Testergebnissen führen. Die Stellen sind so zahlreich, dass ich empfehle, sie bei Interesse direkt der Studie zu entnehmen (pdf mit Markierungen).

Weitere Hinweise im Interview von Kämmerer mit Fiedler auf apolut.net (Abschnitt ca. Minute 16 – 35). Darunter:
– Primer für den PCR-Test (ganz besonders wichtig, wenn der PCR-Tests zum Screenen asymptomatischer eingesetzt werden soll), sind möglichst spezifisch zu wählen. Also so, dass keine bekannten Gene anderer Organismen damit gefunden werden. Dafür gibt es kostenlose Datenbanken, die Primer vorschlagen oder überprüfen. Die von Drosten-Corman gewählten Primer würden schon diesen Basistest nicht bestehen. (Minute 28)
(- weitere Stichworte aus dem Interview: Wobbling-Stellen, Phantom von Heilbronn: DNA von Verpackungsmitarbeiterin in den Stäbchen zur Probennahme, Temperaturführung)

Passagen zu WHO und PCR

Eine wie ich finde sehr vielsagende Auflistung das was die WHO zu PCR Tests wusste und was sie getan hat. Für mich sind das starke Inidzien, dass die WHO aktiv dafür gesorgt hat, dass es viele falsch positive Testergebnisse gibt. Aber sieh selbst:

2020-01-03
[…] the CCDC (2020; also see Chan et al., 2020) had already established an efficient RT-PCR protocol on January 3, 2020 which included specific control samples.

2020-01-05
Chinese scientists had already shared the whole genome sequence of the Wuhan virus with the WHO on January 5, 2020 (WHO, 28 Feb 2020)
Seite 9

2020-01-13
In January 2020, a group of scientists from Europe and Hong Kong (China) developed an RT-PCR protocol that was uploaded on the WHO webpage (WHO, 13 Jan 2020) before publication in
Eurosurveillance (Corman et al., 2020). This so-called Charité protocol served as a blueprint for most of the subsequent protocols at least in Europe and was aimed “to develop and deploy a robust diagnostic methodology enabling its use in a public health laboratory setting without having virus material available”.
Already at this time, it was apparent that the proposed objective was misleading due to the following: Specific biological material (here, the virus of interest) is essential to assure specificity and sensitivity of the test design, but was not available despite its necessity having already been recognized in the published work of the Chinese scientists largely responsible for the creation of the Charité protocol (Zhu et al., 2019; Ren et al., 2020). Further, a proper test design, which respects international standards and includes extremely
specific test materials (primers and probes), was not fulfilled by the Charité protocol. Instead of being designed and checked for maximum specificity without cross-reactivity, the primer design of the Charité protocol allowed a group-specific detection of different coronaviruses of the subgenus Sarbeco.

However, the Charité protocol and primer design was based on a set of synthetic sequences and the SARS-CoV strain Frankfurt-1 as a positive control without even verifying the PCR products by sequencing. Worse still, no cut-off window for the Ct-value was determined in relation to a well-defined, specific viral load control for any of the different target genes.

Summarized, none of the expected requirements, usually mandatory, for a “robust diagnostic test” in any Standard Operating Procedure (SOP) was met in the Charité protocol. Indeed, the need for that protocol was questionable to begin with because
Seite 9

2020-01-17
It is therefore completely incomprehensible why the WHO, during the course of the pandemic, recommended reducing the number of target genes without improving the specificity of the primer design. In the original Charité protocol (published January 13, 2020), testing for three gene targets (E-gene, RdRp-gene, N-gene) was recommended by the WHO, (24 Jan 2021). Doing so, could have limited the number of false-positives. However, in the first modification (published January 17, 2020), PCR-detection of the N-gene (the most specific and in dilution series the least sensitive according to Muenchhoff et al., 2020), and therefore the least frequently occurring false-positive target, was omitted (WHO, 13 Jan 2020).

2020-01-24
Incomprehensibly, this protocol [the more specific CCDC protocol, January 3] was uploaded on the WHO webpage after the Charité protocol and, in parts, only in Chinese (WHO, 24 Jan 2021).

2020-03-02
Worse still, with the second modification (published March 2, 2020), the WHO recommended that “in areas, where COVID-19 virus is widely spread, a simpler algorithm might be adopted, in which for example screening by RT-PCR of a single discriminatory target (i.e., the E-gene) is considered sufficient” (2 Mar 2020). These modifications — especially the final recommendation to test for the highly unspecific E-gene as the sole target — was certain to increase the risk of false-positives thus driving up the case numbers, and, it also was likely to increase the number of false-negatives (Finn & Lucey, 2021; Kanji et al., 2021; Pecoraro et al., 2021).
S. 13

2020-03-16
On March 16, 2020, Ghebreyesus announced the global strategy for handling COVID-19:
“We have a simple message to all countries: test, test, test. Test every suspected case. If they test positive, isolate them and find out with whom they have been in close contact, up to two days before they developed symptoms, and test those people too (WHO, 16 Mar 2020).”
Seite 3

2020-03
In parallel, the WHO launched the COVID-19 dashboard feature allowing real-time tracking of RT-PCR positive test results in absolute numbers independent of the number of tests performed and without further specifying the test system applied. […]
The strategy recommended by the WHO — to test as many people as possible independent of clinical symptoms by this molecular test — seems puzzling, as the RT-PCR technology by itself has insufficient
sensitivity and specificity to verify an intact infectious pathogen like a virus and thus to identify a contagious person, nor can it be used validly to diagnose a disease.
Seite 3

Further, page 9 of a consensus document on the Epidemiology of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) from the WHO (2003), a highly related virus, reads as follows: “Data linkage is required to determine whether there is a direct relationship between clinical severity and viral load and excretion.” This implies that an RT-PCR positive tested individual cannot be automatically considered to be or become symptomatic or infectious without corroborating clinical
symptoms. Therefore, it is incomprehensible that the WHO committed to the RT-PCR test strategy even after publication of a systematic review demonstrating that patient characteristics (i.e., severity of symptoms) and test parameters (i.e., cycle threshold) radically restricts the reliability of the RT-PCR test results (Jefferson et al., 2020). Furthermore, the WHO researchers should have been aware of the pitfalls connected to PCR testing, as in 2007, false-positive results caused a pseudo-pandemic of the whooping cough in the Dartmouth-Hitchcock Medical Center (New York Times, 2007).
Seite 3f

2020-03-19
Although whole or at least partial genome sequencing is recommended by the WHO (19 Mar 2020; 8 Jan 2021; 20 Jan 2021),
the authors of the Charité protocol did not include this important confirmation step, i.e., Sanger sequencing.

2020-01-20
Rather, as recommended by both WHO and CDC, the PCR test will help the physician in confirming or declining an initial suspicion whether a symptomatic patient is suffering from a possible SARS-CoV-2 infection (WHO, 20 Jan 2021; CDCb; CDCc).

2020-01-21
Another unanswered question is why the WHO did not immediately report on the importance of the Ct-value and interpretation of the RT-
PCR test results when the PCR technology was adopted as the “gold standard” to detect SARS-CoV-2? Why did they only do so a full year after the onset of the pandemic (WHO, 20 January 2021)? Why did influential scientists, such as Marion Koopmanns and Anthony Fauci, not call attention to the misuse of the PCR as the so-called “gold standard” for the detection of “infectious” individuals, although they must have known better, as they demonstrated in interviews and podcasts (see Box 1)?
S. 19f

2022 Tao et al
The Charité protocol (Corman et al., 2020) properly specified three target genes to detect SARS-CoV-2, namely the E-gene, the RdRp-gene (which is the ORF-1ab gene coding for the RdRp protein) and the N-gene. However, the primers selected for the Charité E-gene target were defined as specific for the whole Sarbeco group of coronaviruses including SARS and Bat-derived Sarbecoviruses. This
target clearly fails to fulfil the requirements for a specific SARS-CoV-2 detection by design and, consequently, was excluded from analysis in a manuscript testing all WHO-recommended RT-PCR protocols by Tao et al., (2022). Furthermore, the probe from the RdRp target was defined as “Pan-Sarbeco” making it even less specific as a test for SARS-CoV-2.
Seite 11f

 

Übertragungsfähiges Virus nachweisen

Ein PCR-Test weist Gensequenzen nach, je nach Testausgestaltung mit mehr oder weniger Fehlern. Ob es sich in der Probe um Bruchstücke oder aktive Viren gehandelt hat, kann der Test nicht erkennen. In diesem Abschnitt geht es darum auszuloten, was ein positives PCR-Testergebnis über die Ansteckungsfähigkeit aussagt.

Ansteckungsfähigkeit direkt messen

Es gibt ja sehr unterschiedliche Menschen mit unterschiedlich arbeitenden Immunsystemen. Von AIDS bis zu starkem allgemeinen Immunsystem bis hin zu Training auf einen spezifischen Erreger. Das müsste ja berücksichtigt werden. Sowohl bei der Messung aber auch hinterher in der Anwendung. Stichwort vulnerable Gruppen, Stichwort Herdenimmunität.

Dann gibt es ethische Bedenken, Menschen absichtlich einer Infektion auszusetzen.

Möglicherweise gibt es auch technische Probleme Aerosole mit bestimmter Konzentration an aktivem Sars-Cov-II herzustellen. Andererseits gibt es ja Biowaffenlabore, die müssen es ja hinbekommen, die vermehrbare Erreger auszustreuen.

Jedenfalls ist mir während der ganzen Recherchezeit ist nur eine Studie mit einer Handvoll Teilnehmern aus England aufgefallen, die ein direktes Ansteckungsexperiment gemacht hat

Fazit: Ansteckungsfähigkeit wird zumindest offiziell nicht direkt gemessen. Mir ist nicht bekannt, dass es eine Tabelle in der Art „Immunstatus XY -> ZZ Virenexposition führt asymptomatischen Verlauf, YY Virenexposition zu leicher Erkrankung, XX Virenexposition zu schwerem Verlauf.

Zellkulturtest

Eine Möglichkeit zu Überprüfen, ob eine Probe auf ein Ansteckungspotential des Probanden hinweist, ist der Versuch die Viren aus der Probe in einer Zellkultur zu vermehren. (vgl. die Antwort von Eckerle auf sciencemediacenter.de)

Auch zu diesem Verfahren würde ich gerne noch näheres erfahren. Wie wird bestimmt, ob und auch was sich da vermehrt hat?

Wenn ich das richtig verstanden habe, wird die Probe in eine Zellkultur von Epithel oder Darmzellen gegeben. In der sich keine Abwehrzellen befinden, richtig? Das bedeutet, wir testen mit dem Zelltestversuch die Ansteckbarkeit von AIDS-Patienten, richtig? Wobei dann noch zu untersuchen wäre, wie sich die ausgeatmete und aufgenommene Menge zu der Menge in der Probe verhält. Jedenfalls scheint mir der Zellkulturtest ein oberen Schätzwert für sehr vulnerable Menschen zu ergeben.

 

ct-Wert und Anzüchtbarkeit

Ergebnis. Es gibt immer wieder Hinweise aus Untersuchungen, die berichten, bis zu welchem ct-Wert sie Viren aus der Probe anzüchten konnten. Daraus ergeben sich folgende Eckdaten: Kranke Patienten haben oft einen ct-Wert in den unteren 20igern. Wo die Infektiösitätsgrenze liegt, da schwanken die Angaben und hängt auch vom speziellen PCR-Test ab (Hinweis: Kalibieren). Die angegebenen ct-Werte schwanken zwischen 28 und 33.

Beispiele. Aus einem Beitrag von biovis Diagnostik, SARS-CoV-2-Diagnostik: kritischer Rückblick und Update für die Grippesaison, Abschnitt CT-Werte und Viruslast: Ein ct-Wert von 25 bedeutet, dass in 1 Milliliter der Probe ca. 100.000 Viren waren. Bei ct-Werten von 30 sind es noch 100 Viren pro ml. Bei ct-Werten von 33 sind es noch etwa 20 Viren pro ml. Eine Anzucht gelingt nicht mehr. In dem Fall wird geschlussfolgert, dass die Patienten nicht mehr infektiös sind.

Eine andere Einschätzung darüber wieviele Viren in der Probe sein müssen, damit die Anzucht gelingt, steht im Epidemiologischen Bulletin des RKI (39/2020, S. 9). Dort schreiben sie, dass die Grenze für die Anziehbarkeit bei 1.000.000 bis 10.000.000 Viren pro ml liegt. Das RKI schweigt an dieser Stelle über den zu erwartenden ct-Wert.

Auf coronatest.de findet sich im Abschnitt „Ist man bei geringer Viruslast trotzdem ansteckend?“ folgendes: „Untersuchungen des Robert Koch-Instituts (RKI) haben gezeigt, dass Coronaviren ab einem CT-Wert von 30 nicht mehr im Labor vermehrt werden können. Das bedeutet, dass Infizierte nicht mehr in der Lage sein dürften, andere anzustecken. Dennoch gilt ein solches Testergebnis als positiv – betroffene Personen müssten sich in diesem Fall trotzdem in Quarantäne begeben. Erst wenn nach 37 oder 40 Vermehrungszyklen kein Virus nachgewiesen wird, wird ein Testergebnis als negativ eingestuft.“
Zum einen: Ich bestehe auf einer vollständigen Quellenangabe. So wischiwaschi kann ich nicht diskutieren. Dann die Frage: Warum erst bei 37 oder 40 Zyklen negativ eingestuft? Das begründen sie auch, nämlich mit einer Reihe von Faktoren, die dazu führen können, dass der ct-Wert höher ausfallen kann (wieder keine genauen Quellenangaben, Experten, Experten …). Ein Sicherheitspuffer also. Stellen sich zwei Fragen: Könnte es sein, dass diese Reihe von Faktoren schon bei der Bestimmung des RKI-Werts von maximal 30 Zyklen eine Rolle gespielt haben und diese Faktoren damit doppelt berücksichtigt werden (Könnten wir jetzt nachsehen, wenn denn die Quellen angegeben worden wären.)? Und zweitens: Die Höhe des Puffers ist doch einen politische Entscheidung, richtig? Also wer mit welchen ct-Werten und gegebenfalls 2. und 3. Tests wie lange in Quarantäne muss, ist Sache der Bundesregierung oder welche Regierung dafür sonst zuständig ist. Es ist nicht Aufgabe des RKI, oder?

Aus dem Ärtzeblatt 01–02–2021: „Positive Viruskulturen wurden nur bei Patienten mit einem Zyklusschwellenwert von 28,4 oder weniger nachgewiesen.“ 

 

Zeitlicher Verlauf des ct-Werts im Laufe eine Infektion mit Covid-19

Wie sieht der zeitliche Verlauf von ct-Werte im Verlauf einer typischen Infektion aus? Und welche Schlussfolgerungen ergeben sich für die Interpretation von positiven Testergebnissen und den Einsatz weiterer Maßnahmen?

Zu Beginn sind noch nicht so viele Viren da (hoffentlich auch nur in den Schleimhäuten). PCR-Testung ergibt einen hohen ct-Wert. Es kann sein, dass das Immunsystem, das Virus schnell unter Kontrolle bekommt. Es kann auch sein, dass es das nicht schafft und der Mensch krank wird, mit entsprechend mehr Viren.

Schlussfolgerung: Bei beginnenden Infektionen weiteren Verlauf beobachten.

Beim RKI hört sich das so an: „Bei niedrigen Genomlasten (d.h. hohen Ct-Werten) ist es ohne weitere Kenntnisse zu den Umständen der Probennahme nicht möglich eine Aussage darüber zu treffen, ob sich der Patient in der frühen Phase des Infektionsgeschehens befindet und an den folgenden Tagen höhere Virusmengen produzieren könnte. Für die Beurteilung müssen folglich weitere Kriterien, wie z.B. eine bekannte Exposition bzw. die klinische Symptomatik, herangezogen und ggf. wiederholte Verlaufsproben untersucht werden. Da bei niedrigen Genomlasten die Varianz bei der real-time PCR zunehmen kann, sind exakte quantitative Aussagen schwierig zu treffen.“ (Quelle: Epidemiologischen Bulletin des RKI 39/2020, S. 9)

 

Nehmen wir an, es kommt zu einem mittleren Verlauf, der Körper bekommt dann die Viren in den Griff. Der ct-Wert ist erstmal deutlich gefallen und zeigt damit mehr gefundenes Genmaterial an. Soweit, so eindeutig.

Was passiert dann? Eine Annahme wäre, dass die Krankheit abklingt und die ct-Wert kontinuierlich ansteigen und der Test irgendwann negativ ausfällt. So einfach ist es aber leider nicht. Einen ersten Eindruck davon vermittelt eine Abbildung im Anhang der Studie Epidemiologic Features and Clinical Course of Patients Infected With SARS-CoV-2 in Singapore. Dort sind die ct-Werte für 18 Patienten im Verlauf einer Behandlung wiedergegeben, eFigure 3. Es ist zu erkennen, dass die ct-Werte zwar in etwa den zu erwartenden Trend haben, aber einen deutlich gezackten Verlauf haben, der zudem individuell sehr unterschiedlich ist und das über 2-3 Wochen.

Dazu passt auch folgende Meldung: Einzelne genesene COVID-19-Patienten positiv auf SARS-CoV-2 getestet, auf sciencemediacenter.de März 2020. ( (vgl. auch RKI: Positive PCR-Ergebnisse bei Genesenen)

Was könnte da passieren?
Zum einen könnte es sein, dass tatsächlich die Virenaktivität in den jeweiligen Fällen schwankt. (Ist das typisch bei Krankheiten? Frage an Praktiker.)
„Außerdem kann die Virusmenge im Rachen während der Infektion stark schwanken – besonders später, wenn sich das Virus hauptsächlich in der Lunge befindet, erfasst das Wattestäbchen womöglich gar keine Viren mehr.“ (Quelle: Wie funktionieren die neuen Corona-Tests? in spektrum.de von April 2020, Abschnitt „Die Nachteile der RT-PCR“.)

Gegen Ende der Erkrankung gibt es zudem die Möglichkeit, dass der Test noch positiv ausschlägt, aber keine Ansteckungsgefahr mehr gegeben ist. Das kann sein, weil noch Virentrümmer im Körper sind, aber keine aktiven Viren. Der Test kann dies jedoch nicht unterscheiden. Einen Möglichkeit dies festzustellen, ist wieder ein Zellkulturtest, der allerdings warum auch immer ein paar Tage dauert. Eine im Ärzteblatt besprochene Untersuchung ist dieser Frage nachgegangen und hat festgestellt, dass die Infektiösität lange schon nicht mehr gegeben ist, wenn der PCR-Test dann negativ ausfällt. (Quelle SARS-CoV-2: Infektiosität lässt auch in positiven Abstrichen frühzeitig nach)

Schlussfolgerung: In der Krankheitsphase ist ein negativer PCR-Test womöglich darauf zurückzuführen, dass das Virus nun in der Lunge aktiv ist und nicht mehr in den oberen Atemwegen. Die ct-Werte in der Abklingphase weisen Aufs und Abs auf. Zudem verschwindet die Infektiösität schneller als die positiven Testergebnisse. Der PCR-Test ist in dieser Phase also ein nachlaufender Indikator.

 

Falsch positive Tests: Kleiner Fehler, große Wirkung

In diesem Abschnitt geht es darum dafür zu sensibilisieren und zu begründen, warum die Mehrheit der ersten positiven Testergebnisse falsch-positiv sind.

Gründe für falsch-positive Testergebnisse

Nobody is perfect – auch die PCR-Tests sind es nicht. Auch wenn sie selbst kleine DNA-Spuren der gesuchten DNA sichtbar machen können, geben sie auch immer wieder falschen Alarm. Eine Übersichtsdarstellung, warum das so ist und wie stark die jeweiligen Effekte wirken, habe ich nicht gefunden. Aber ein Sammelsurium von Möglichkeiten, die zu falsch-positiven Testergebnissen führen können, hat sich zusammengefunden:

• Gestaltung der Primer und des Testprotokolls (siehe oben PCR: mehr Details): Anzahl der Gensequenzen, auf die getestet wird, Lage dieser Gensequenzen im Genom. Länge der Gensequenzen. Einzigartigkeit dieser Gensequenzen. Dann Konzentration der Primer und der anderen Zusatzstoffe, Temperaturführung.
• Ein hoher ct-Wert erhöht auch die Wahrscheinlichkeit von falsch-positiven. (vgl. in dieser Richtung notesfromthesocialclinic.org Fußnote [6])
• Dann spielen die Qualität der verwendeten Zutaten eine Rolle. (vgl. Die Evolution des „Drosten-Tests“ zur Ein-Gen-PCR auf corodok.de, Abschnitt vor „Der Standard-Diagnostikfall […]“)
• Es gibt Hinweise auf Kreuzreaktionen mit der Grippe und anderen Coronaviren, die für falsch-positive Testergebnisse sorgen. Primer, die auf das E-Gen des Sars-Cov-II Virus testen, springen wahrscheinlich auch auf Sars-Cov-I an. Die Übereinstimmung dieser Sequenz mit anderen gängigen Coronaviren liegt in der Größenordnung von 50% (Quelle: Does the E gene provide additional information in SARS-CoV-2 PCR? auf National Library of Medicine). Und können daher auch zu falsch-positiven Resultaten führen (Siehe oben). Ohne dass andere Viren vorgelegen haben, wurde in einem Ringversuch eine Falsch-Positiv-Rate von 1,4% ermittelt. Waren andere Coronaviren präsent, stieg die Falsch-Positiv-Rate auf bis zu 7,4%. (Vgl. Zusammenfassung Ringversuch auf transition-news.org)
• Falsch-negative Ergebnisse können auch aufgrund schlechter Probenqualität oder unsachgemäßem Transport nicht ausgeschlossen werden. (Quelle: RKI, Hinweise zur Testung, Abschnitt Leistungsparameter Diagnostischer Tests)

 

Test positiv? Wahrscheinlich falsch-positiv!

Nehmen wir an, der Test habe eine Spezifität von 99%, d.h. von 100 Proben ohne Sars-Cov-II erkennt dieser Test 99 als negativ und 1 als positiv, falsch-positiv. Klingt ersteinmal vertrauenserweckend, oder? 1 falscher Befund auf 99 richtige, ganz gut.
Nur: Wieviele Tests ohne Sars-Cov-II müssen denn durchgeführt werden, um 1 echt positiven zu erwischen? Sagen wir das Virus sei in knapp 1% der Bevölkerung virulent und wir testen querbeet, d.h. zufällig 101 Menschen. Sagen wir 1 Mensch von den 100 hat das Virus. Sagen wir, der Test erkennt diesen 1 Virusaktivisten als positiv. Wir testen aber auch die 100 Menschen, die eigentlich negativ sein sollten. 1 davon wird als falsch-positiv erkannt. Wir haben also 2 positive, 1 davon falsch-positiv. Macht eine Falsch-Positiv-Rate von 50%. Das hört sich nicht gut an, insbesondere wenn an diese Lotterie Folgen wie Quarantäne und Lohnausfall geknüpft werden.

Wusstest du das? Das Phänomen ist bekannt und wird auch von offiziellen Stellen beschrieben. Beispielsweise heißt es in der WHO Information Notice for Users 2020/05:

„WHO reminds IVD users that disease prevalence alters the predictive value of test results; as disease prevalence decreases, the risk of false positive increases (2).„
(deutsch: die WHO erinnert In Vitro Diagnostik Nutzer daran, dass die Prävalenz der Krankheit den Vorhersagewert des Testergebnisses ändert; mit abnehmender Prävalenz der Krankheit steigt das Risiko von falsch-positiven.)

Die Prävalenz ist die für die Sars-Cov-II-Tests die Wahrscheinlichkeit infiziert zu sein, bevor das Testergebnis bekannt ist. In obigem Beispiel wäre das 1%.

 

Der Zusammenhang wird mit dem Satz von Bayes beschrieben. Der Satz von Bayes lautet:

P( Inf | Tpos ) = P(Tpos | Inf ) * P( Inf ) / P( Tpos )

Die Wahrscheinlichkeit eine Infektion zu haben, wenn es ein positives Testergebnis gibt, P( Inf | Tpos ), ist gleich der Wahrscheinlichkeit, dass der Test bei einer Infektion auch positiv wird, P(Tpos | Inf ), multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass eine Infektion vorliegt, P( Inf ), dividiert durch die Wahrscheinlichkeit, dass der Test positiv wird, P( Tpos ).

P ( Tpos ) kann zusammengesetzt werden aus:

P(Tpos) = P(Tpos | Inf ) * P( Inf ) + P(Tpos | keine Inf ) * P( keine Inf )

Die Wahrscheinlichkeit, dass der Test positiv wird, ist die Summe aus der Wahrscheinlichkeit, dass der Test positiv wird, wenn eine Infektion vorliegt, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit für eine Infektion, und der Wahrscheinlichkeit, dass der Test positiv wird, wenn keine Infektion vorliegt, mulitpliziert mit der Wahrscheinlichkeit, dass keine Infektion vorliegt.

 

falsch-positiv Test-Rechner

Mach den Test! Welche Werte hälst du für realistisch aktuell? Stell die vor, dein Test ist positiv. Wie wahrscheinlich ist er falsch-positiv?

Prävalenz, P( Inf )
Wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit im Vorhinein, dass eine Infektion vorliegt:  %.

(1 – Test-Spezifität), P( Tpos | keine Inf )
Wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Probe, in der kein Sars-Cov-II vorhanden ist, trotzdem ein positiv Ergebnis bekommt:  %.

Test-Sensitivität, P( Tpos | Inf )
Wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Probe mit Sars-Cov-II ein positiv Ergebnis bekommt:  %.

Dann ist die Wahrscheinlichkeit, eine Infektion zu haben, wenn der Test positiv ausfällt: [P( Inf | Tpos )] %.

Oder andersherum: Dann ist die Wahrscheinlichkeit dafür, dass ein positiver Test ein falsch-positiver Test ist  [Ergebnis] %.

 

Führen wir das Beispiel von oben weiter. Sagen wir, ich bin derjenige, der den positiven Testbescheid bekommen hat. Da ich keine Lust habe mit 49,7% Fehlerwahrscheinlichkeit in Quarantäne zu gehen, mache ich noch einen Test. Durch das Testergebnis im ersten Anlauf ist die Prävalenz, dass ich einen Genmaterial des Virus in mir habe, auf 50,3% gestiegen. 50,3% Prävalenz und 1% Wahrscheinlichkeit, dass eine negative Probe als falsch-positiv erkannt wird, und 100% Sensitivität: Dann ist die Wahrscheinlichkeit 1%, dass ein positives Testergebnis ein falsch-positives Ergebnis ist.

 

Welche Prävalenzen und Spezifitäten sind realistisch?

• Das RKI ist gefragt, solche Zahlen zu ermitteln und zu kommunizieren.
• Für die Prävalenz können wir aus „den Inzidenzen“ eine Schätzung ableiten. Zusätzlich kann berücksichtigt werden, ob sich die Infektionen vielleicht in bestimmten Bevölkerungsgruppen häufen und dafür in anderen Gruppen geringere Inzidenzen vorliegen.
• Für die Spezifität (falsch-positive) haben wir Anhaltspunkte aus dem ersten Abschnitt oben.

Beachte ist, dass hier noch nicht die Frage nach der Ansteckungsfähigkeit herausklämüsert worden ist. Wenn ich das richtig herausgehört habe, beziehen sich die Quoten für falsch-positive und falsch-negative auf Kontrollexperimente mit Genschnipseln.

 

Fazit falsch-positive

Der Anteil der wahrscheinlich falsch-positiven ist bei den veröffentlichten Inzidenzen mit anzugeben. Das ist insbesondere dann wichtig, wenn die Inzidenzen niedrig sind.

Zur Begründung von Maßnahmen, die einzelne Individuen betreffen, reicht 1 Test nicht aus.

 

Links Satz von Bayes und Prävalenzen

Das RKI hat tatsächlich auch einen falsch-positiv Rechner – aber nur mit Login benutzbar?! hier.

Update Your Beliefs Systematically – Bayes’ Theorem, auf Youtube Kanal Veritasium.

Diagnostic Testing: impact of confirmatory testing on false positives using Bayesian networks, Youtubekanal Norman Fenton.

Ohne die Angabe von Vertrauensintervallen oder Irrtumswahrscheinlichkeit sind wissenschaftliche Ergebnisse wertlos. Beitrag auf sciencefiles.org.

PCR-Tests auf SARS-CoV-2: Ergebnisse richtig interpretieren, Ärzteblatt.

 

Ist die Spike-Impfung ein Grund für falsch-negative Testergebnisse?

In diesem Abschnitt geht es um einen etwas kuriosen Fund von allerdings potentiell großer Tragweite: Schützen die Spike-Impfungen vor einem positiven PCR-Test statt vor Krankheit? Dass das für Ermittlung der Impfeffektivität eine große Bedeutung hat, liegt auf der Hand. Für die PCR-Tests wäre dies ein Einflussfaktor auf die flasch-negativen Rate.

Es geht um folgende Merkwürdigkeit: Im Januar 2022 veröffentlicht die CDC eine Studie. Im Untersuchungszeitraum zu Zeiten von Omicron werden 460 Impfstofffreie und 1.117 Geimpfte hospitalisiert, alle mit covid-ähnlichen Symptomen. Ein PCR-Test auf Sars-Cov-II wird bei den Impfstofffreien zu 36% positiv, bei den Geimpften nur zu 11%. Also: Alle diese Hospitalisierten haben covid-ähnliche Symptome, aber der PCR-Test wird bei den Geimpften deutlich weniger oft positiv! Was ist da los?
(Quelle: Zahlen aus Tabelle 2 der CDC Studie Effectiveness of a Third Dose of mRNA Vaccines Against COVID-19. )

Auf das Phänomen wird in diesem Beitag hingewiesen: The Pandemic of PCR-Negative COVID-Like Illness. Der Autor schlägt als Erklärung vor, dass die Impfung vielleicht Sars-Cov-II verdrängt und damit Platz für andere Viren mit ähnlichen Effekten schafft. Oder es ist ein ADE-Effekt, bei dem die Antikörper der Impfung zwar im Rachen- und Nasenraum dafür sorgen, dass der Test nicht positiv wird, aber die Krankheitssymptome trotzdem da sind.

Stellt sich die Frage, was dieser Befund für die Anwendung von PCR-Tests bedeutet. Bei Geimpften mit covid-ähnlichen Symptomen ist damit zu rechnen, dass der PCR-Test weniger oft positiv ausfällt. Ob dies berechtigterweise geschieht, weil die Symptome von anderen Erregern als Sars-Cov-II verursacht werden, oder ob die Impfung Sars-Cov-II Infektionen nur verschleiert und damit der Test eher falsch-negativ ergibt, bleibt an dieser Stelle offen und ruft nach weiteren Untersuchungen.

 

Anwendungsleitlinie für eine fachgerechte Anwendung des PCR-Tests

In diesem Abschnitt geht es darum, aus den vorangegangenen Ausführungen und anderen Ausführungen zum Thema eine Checkliste zusammenzustellen, mit der die Qualität der Teststrategie überprüft und diskutiert werden kann. Sie hat keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

Gestaltung der Testkits

Primer: Am besten 3 Primer-Sets, eine vom Beginn der Virusgensequenz, eine aus der Mitte und eine vom Ende.

Testdurchführung ausgestalten: So, dass wenig falsch positive entstehen. (Temperaturführung, Konzentrationen der beteiligten Stoffe, etc.)

Testgüte ermitteln für Standardfälle. Dabei Vorkommen anderer Erkältungsviren simulieren. Monitoring und Angabe von Vertrauensintervallen.

Kreuzreaktionen Qualitätsmanagement

Was machen mit Kreuzreaktionen. Also beispielsweise bei einem Primer auf das E-Gen kann nicht so gut aber wohl doch auch eine anderes Coronavirus erkannt werden (s.o.). Dieser Fehlalarm würde auch durch eine Kontrollprobe mit dem gleichen Testkit wieder zu einem Fehlalarm führen. Wie damit umgehen?

Für jedes Primerset bekannte Gensequenzen zusammenstellen, bei denen Kreuzreaktionen möglich sind (40%+ Übereinstimmung z.B.)

Test mit mehreren Primern konstruieren, bei denen die anderen Primer bekannte Kreuzreaktionen des ersten Primers nicht mitmachen.
Oder: Vorkommen des Kreuzreaktionsgens beobachten. Breitet es sich aus, anderen Primer nehmen oder zusätzliche.

Was machen mit bisher unbekannten Kreuzreaktionen? Planmäßiges Vergleichsanalysen mit unterschiedlichen Primern, oder?

Kalibrieren: Die unterschiedlichen Testkits sind zu kalibrieren, so dass die ct-Werte vergleichbar sind. Ein entsprechendes Eichmaß hat Herr Drosten wohl entwickelt (Beitrag auf multipolar.de)

Angabe des (kalibrierten) ct-Werts

Quarantänemaßnahmen nur bei positivem Test mit hoher Prävalenz: also mit eindeutigen Symptomen, oder 2. Test

 

Bei positivem Test zu Beginn einer Infektion: Zeitnahe Kontrollprobe, um auf kurzen Infektionsverlauf zu prüfen.

Positiver Test bei Genesenen: Vielleicht noch alte Virenbruchstücke gefunden? Weiteren Verlauf beobachten.

Negativer PCR-Test bei Gimpften in der Schutzwirkungsphase, Thematik der Covid-like-illness ohne positiven PCR-Test (s.o.). Phänomen auf den Grund gehen. Negatives Testergebnis bei Symptomen hinterfragen.

Abklingende Erkrankung: PCR-Test liefert schwankende ct-Werte und Ansteckungsfähigkeit geht schneller zurück als PCR-Test negativ wird. Möglichkeit für einen schnellen Zellkulturtest?

Ansteckungsfähigkeit klären. Wenn möglich Zusammenhang mit ct-Wert elaborieren.

Kommunikation / Methodik: Transparenz schafft Vertrauen und Qualität

An die Politik: Welche technischen und organisatorischen Abwägungen werden vorgenommen?

 

Links zu weiteren Anwendungsleitlinien

Die WHO informiert Anfang 2021 (WHO Information Notice for Users 2020/05)
– Bei hohen ct-Werten vorsichtig interpretieren.
– Passt das Testergebnis nicht mit der Symptombild zusammen, nochmal testen.
– Es wird nochmal daran erinnert, dass es bei niedriger Prävalenz vermehrt zu falsch-positiven Testergebnissen kommt.

 

Kosten / Nutzenüberlegungen für anlasslose Testungen, aus einer Anhörung des Gesundheitsausschusses (bundestag.de). Vorschlag. Testen bei Symptomen für schnelle Ergebnisse, und eine Kontrollgruppe für einen Überblick über das Infektionsgeschehen.

 

Auszug aus der Stellungnahme zur Teststrategie, von Werner Bergholz, Oktober 2020:

1. Umgehende Standardisierung des PCR – Test Verfahrens, sonst gibt es keine zeitliche und örtliche Vergleichbarkeit der Daten.
2. Laufendes Monitoring der Spezifität und Sensitivität des Tests für jedes beteiligte Labor und Berücksichtigung der falsch positiven Rate bei der statistischen Analyse auf kommunaler, Landes- und Bundesebene, sonst entstehen irreführende Trends.

https://www.multipolar-magazin.de/artikel/erwunschter-blindflug

 

Wie wird der Test tatsächlich angewendet?

In diesem Abschnitt geht es nun darum, wie die PCR-Tests in Deutschland angewendet werden und diese Anwendungspraxis mit der Anwendungsleitlinie zu beurteilen.

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Erfahrung I: Ein positiver Schnelltest

Mit dem positiven Testergebnis kommt ein Infoblatt mit interessanten Punkten (Hessen Juni 2022, aber wohl zu dem Zeitpunkt veraltet):

• Sofortige 14 Tage Quarantäne.
• Haushaltsmitglieder müssen sich auch absondern. Gilt nicht für Haushaltsmitglieder, die in den letzten 3 Monaten selbst positiv getestet worden sind.
• Es kann ein PCR-Test gemacht werden.

Was auffällt ist, dass nicht auf die hohe Zahl von falsch-positiven bei asymptomatisch getesteten hingewiesen wird. Es wird darüber nicht informiert und auch nicht nahegelegt, das Ergebnis mit einem 2. Test zu überprüfen.

Durch die Option zu einem PCR-Test werden immerhin eine Reihe von Problemen abgefangen. Zum einen das Problem mit den falsch-positiven. Zum zweiten wohl auch, wenn der Körper mit dem Virus ratz-fatz fertig wird und die 14 Tage unangemessen sind. Für das Ende der Quarantänezeit lässt sich der Test vielleicht auch zum Freitesten einsetzen, wobei die Formulierung nicht so eindeutig ist, und wir oben ja auch gesehen haben, dass der PCR-Test einer Abnahme der Infektiösität hinterherläuft.

Was das mit den Haushaltsmitgliedern soll, ist mir unklar.

Erfahrung II: Ein positiver PCR-Test

Beispiel für einen positiven PCR-Test von Anfang Juni 2022 (pdf).

Immerhin: Es wird ein ct-Wert berichtet.

Was nicht berichtet wird: Ein kalibrierter ct-Wert. Auch nicht: Ein Wert, ab dem der Test als positiv gewertet wird. Das spezielle PCR-Kit mit entsprechenden Vertrauensintervallen, den verwendeten Primern, möglichen bekannten Kreuzreaktionen sowie Zertifikate oder Links zu Qualitätssicherungsmaßnahmen.

 

Links zu Quellen, die Auskunft über die verwendeten PCR-Tests geben
Cullen et al The performance of the SARS-CoV-2 RT-PCR test as a tool for detecting SARS-CoV-2 infection in the population (Juni 2021). Infos über ein Testzentrum im Münster.

 

Qualitätsüberwachung

Zu dem Thema habe ich gefunden:

„In einem sogenannten Ringversuch hat man die Spezifität des PCR-Tests zu ermitteln versucht und fand einen Wert zwischen 97,8 % und 98,6 %. Da eine hundertprozentige Spezifität in der Praxis nicht möglich ist, gehen wir also für die weiteren Rechnungen davon aus, dass die Spezifität zwischen 98 % und 99,5 % liegt.“ (Quelle: Rießinger / Horn, Beitrag auf reitschuster.de, März 2021)

Eine Umsetzung der nach Drosten vorhandenen Kalibrierungsmöglichkeit ist mir nicht bekannt.

 

Angaben auf der RKI-Website

Was findet sich auf der Website des RKI zu den PCR-Tests, insbesondere was die Sicherstellung und Kommunikation der Qualität angeht?

Was ich finde, ist eine relativ detaillierte Aufschlüsselung der Themen im Zusammenhang mit den Tests. Und Empfehlungen. Aber keine dokumentierten Qualitätsüberprüfungen:

„Spezifität. […] Dem tragen z. B. „Dual Target“ Tests Rechnung. Unabhängig vom Testdesign sind jedoch grundsätzlich die für einen Test vorliegenden Daten zu den Leistungsparametern entscheidend.“
Zu sagen „zum Beispiel“ reicht mir an der Stelle nicht.

„Die Labore sind gehalten, regelmäßig an entsprechenden Ringversuchen teilzunehmen.“

„Ein exakt quantifizierter Standard kann dazu verwendet werden, die erhaltenen Ct-Werte in eine RNA- Kopienzahl pro Reaktion und ggf. pro Probenvolumen umzurechnen; so lässt sich der Bezug auf publizierte Daten zur Replikationsfähigkeit des in der Probe enthaltenen Virus in geeigneten Zellkulturen erleichtern (s. unten). Für die Nukleinsäure-gestützte Diagnostik stehen international verschiedene Referenzmaterialien, hier insbesondere RNA von SARS-CoV-2, zur Verfügung (die Liste erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit): […]“

 

Interessant vielleicht noch die Hinweise zur Testung von asymptomatischen und geimpften:

„Von einer massenhaften ungezielten Testung von asymptomatischen Personen wird aufgrund der unklaren Aussagekraft eines negativen Ergebnisses (lediglich Momentaufnahme) in der Regel abgeraten.“

„Geimpfte Personen weisen häufiger asymptomatische und paucisymptomatische Verläufe auf (z. B. Präsentation mit Schnupfen, Hals- oder Kopfschmerzen [siehe https://covid.joinzoe.com/post/new-top-5-covid-symptoms]) als ungeimpfte Personen (Antonelli et al., 2021). Testkonzepte in besonders vulnerablen Bereichen müssen dies berücksichtigen und behalten, unabhängig vom Impfstatus, eine wichtige Bedeutung.“

 

Das Corman-Drosten Protokoll

Ganz zu Beginn der Krise haben XY und Drosten ein PCR-Testverfahren aufgesetzt, mit dem Sars-Cov-II nachgewiesen werden sollte. An dem Test ist eine Menge kritisiert worden. im Wesentlichen sind die Testgrößen so gewählt worden, dass falsch-positive wahrscheinlicher werden. Die offensichtlichste Unsinnigkeit ist ein ct-Wert von 45.

Wer sich näher damit beschäftigen will, findet oben eine etwas detailliertere Einführung zu PCR-Tests, als Hintergrund, um die Kritik an dem Test diskutieren zu können, und dann weitere Infos auf folgenden Seiten:

• Seite Corman-Drosten Review (wurde retracted warum auch immer)
• Robert Young, Frage Nummer 4

 

Bemerkenswert ist, dass in der ersten Version des Tests noch 3 Primerpaare eingesetzt worden sind. Die 3 Primerpaare habe nicht das gesamte vermutete Genom von Sars-Cov-II umspannt, aber immerhin. Dann sind Folgeversionen herausgekommen, die erst nur noch 2 und dann nur noch auf 1 Primerpaar haben. Viele Test prüfen jetzt wohl nur noch auf einen Genabschnitt des sogenannten E-Gens. (siehe oben zu möglichen Kreuzreaktionen) (Quelle: achgut.com)

Mehr zum Corman-Drosten-Protokoll in der Studie von Kämmerer et al, Auswertung oben.

 

Können die PCR-Test Sars-Cov-II Viren von Grippeviren unterscheiden?

Leider habe ich dazu keine 100% wasserdichte Argumentation gefunden. Klar ist, dass PCR-TEsts bei gutem Design die Viren einigermaßen unterscheiden könnten. Wenn aber nur 1 Primer auf das E-Gen verwendet wird und der Prozess unsauber geführt wird, dann wird die Unterscheidungskraft kleiner. Das betrifft insbesondere andere Coronaviren.

Wie die möglichen Genverwechselungsmöglichkeiten bei den anderen Grippeviren aussieht, weiß ich nicht.

Eine Meldung dazu, eine Anfrage an das Berliner Abgeordnetenhaus: Die Antwort lässt den Rückschluss zu, dass die verwendeten PCR-Tests Sars-Cov-II Viren und andere Grippeviren nicht gut auseinanderhalten können. Allerdings wäre eine Antwort, die auch die zugrundeliegenden Mechanismen erläutert, wünschenswert und zuverlässiger.
(Quelle: Bahner Rechtsgutachten zur Untauglichkeit des PCR-Tests, eine akute Infektion mit dem Sars-Cov-II Virus nachzuweisen, S.23f)

Mitte 2021 lässt die CDC einige PCR-Tests auslaufen. In der Begründung heißt es, dass Multiplexverfahren besser geeignet seien, Influenzaviren und Sars-Cov-II-Viren auseinanderzuhalten. Das wurde zum Teil so interpretiert, dass die PCR-Tests bis dahin die Unterscheidung nicht hinbekommen haben. Es gibt aber auch Argumente dafür, dass das CDC zu einem Testverfahren übergehen wollte, dass gleich beide Viren bestimmen kann. Also kein Problem der Spezifität, sondern eine Effizienzmaßnahme.
(CDC Changes to CDC RT-PCR for SARS-CoV-2 Testing. PCR test recall: Can PCR tests tell the difference between COVID-19 and the flu?)

Das eine sorgfältige Entwickung und Überwachung der Tests wichtig ist, zeigt auch folgende Meldung: Demnach ist eine Gensequenz, die bei der WHO als einen mögliche Gensequenz für Primer gelistet ist, die Sars-Cov-II nachweise sollen, eine Gensequenz, die auch im menschlichen Erbgut vorkommt: BOMBSHELL: WHO Coronavirus PCR Test Primer Sequence is Found in All Human DNA

 

Fazit zur Anwendungsleitlinie

Von der Anwendungshinweisliste wird erfüllt: Es werden mittlerweile ct-Werte angegeben. Es besteht die Möglichkeit, nach einem positiven Antigenschnell-Test zu einem 2 Test, einem PCR-Test. Das war meines Wissens lange Zeit nicht der Fall, was viele mit falsch positiven Tests in Quarantäne gebracht hat.

Ein konsequentes Qualitätsmanagement der Tests und der Labore ist nicht zu entdecken. Darunter leidet die Aussagefähigkeit und die Vergleichbarkeit der Tests. Es besteht der Verdacht, dass die Anzahl der Primer reduziert worden ist und auch so gewählt worden ist, dass mehr falsch-positive Testergebnisse entstanden sind, als durch eine gewissenhafte Auswahl möglich wäre.

Eine sorgfältige Aufbereitung der unterschiedlichen Infektionssituationen (Vorsymptomatische Phase, Krankheitsphase, Abklingphase) aus denen dann die Maßnahmen wie Teststrategie und Quarantäneregeln abgeleitet werden, ist mir auch nicht begegnet.

 

Fazit: Rolle des PCR-Tests in der Pandemie

In der pandemiekritischen Diskussion gibt es das Argument, dass die Pandemie mit Hilfe von falsch-positiven PCR-Tests herbeigetestet worden sei. Damit wären dann auch die Maßnahmen sachlich nicht notwendig gewesen. Was ist meine Einschätzung dazu?

Im Großen stimme ich zu, im Detail würde ich anders argumentieren.

Das Aufblasen der Fallzahlen wurde mit einer Reihe von Maßnahmen bewerkstelligt. Der PCR-Test als solcher hätte nicht unbedingt dazu führen müssen. Maßnahmen waren:

• der viel zu hohe ct-Wert,
• die Wahl einer Prozesstemperaturführung, die mehr Falschpositive ergibt,
• die Reduzierung der Primeranzahl von 3 auf 1, was mehr Verwechslungsmöglichkeiten erlaubt,
• der Verzicht auf zweite Tests bei einem positiven Ersttest, was bei Massentestungen mit einem relativ geringen Infektionsgeschehen selbstredend sein müsste,
• keine Kohortenbildung und Testen einer wohldefinierten Gruppe, sondern undokumentiertes Ausweiten der Tests.

 

Alternativen: Grippe-Web, Arbeitsgemeinschaft Influenza & Co

Update 2024-02
Auch vor Corona wurde ein Auge auf das Infektionsgeschehen in Deutschland geworfen. Beispielsweise berichtet ein Sample von Arztpraxen des Grippe-Web und der Arbeitsgemeinschaft Influenza an das RKI, wie sich die Infektionslage bei den ihren vorstelligen Patienten entwickelt. Inklusive übersenden einer Probe zwecks Erregerbestimmung. Dies ist eingeübte Praxis. Und ergab im Jahr 2020 keine Auffälligkeit. Corona war zu unbedeutend, als dass es sich in dieser Erhebung niedergeschlagen hätte.

Weitere Möglichkeiten, um einen Eindruck von der Infektionslage zu erhalten: Das Intensivregister, das die Auslastung der Intensivstationen darstellt und die Sterblichkeitsdaten des statistischen Bundesamtes.

Siehe für einen ersten Einblick Corona laut RKI „unterhalb des Radars“, auf achgut.com von Ende 2020.

Links

Zur Teststrategie allgemein: siehe den Beitag Fallzahlen: eine Frage der Bezugsgröße.

Ein Artikel, der eine lebhafte Impression vom Erfinder des PCR-Test, Karry Mullis, gibt, und von der Geschichte des PCR-Tests: Was the COVID-19 Test Meant to Detect a Virus? auf uncoverdc.com.

Zwei Beispiele von früheren Testpandemien. Ein Krankenhausausbruch von Husten und Schweinegrippe. Beitrag auf thomasbinder.ch.

Update 2022-12: Es gibt einen Hinweis darauf, dass die PCR-Tests Ende 2021 in den USA und Anfang 2022 in der EU geändert worden sind. Eventuell in der Richtung, dass nun auch Gimpfte positive Tests haben. Andeutung dazu auf tkp.at.

Update 2024-02: Es gab im Mai 2020 wohl schon einen Test mit dem die Ansteckungsgefahr deutlich besser eingeschätzt werden konnte. Von den PCR-Positiven ohne Symptome schlug dieser Test nur bei 4% an. Der Test beruht auf dem Nachweis von „Minus-Strang-RNA als Surrogat für das sich aktiv replizierende schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2„. Auf tkp.at.

Update 2024-06
Wie die PCR-Tests in den RKI-Protokollen auftauchen, siehe dazu die Auswertung der RKI-Protokolle in Bezug auf das Thema testen.

Update 2024-08
Ein Infoblatt der MWGFD zu PCR-Tests, auf mwgfd.org